本文是一篇水稻的蛋白質(zhì)組學(xué)文章，作者希望通過比較富硒和非富硒水稻的蛋白表達(dá)差異研究關(guān)鍵的基因與通路。
這項工作被指定為使用相對和絕對定量（iTRAQ）蛋白質(zhì)組學(xué)方法的等壓標(biāo)簽研究天然富硒和非富硒水稻中蛋白質(zhì)差異表達(dá)的方法。提取的蛋白質(zhì)經(jīng)過酶消化，脫鹽，并通過iTRAQ結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)進(jìn)行鑒定。進(jìn)行高pHC18分離分析，然后通過ProteinPilotTM（V4.5）搜索引擎分析數(shù)據(jù)。通過比較相對定量的蛋白質(zhì)來搜索蛋白質(zhì)差異表達(dá)。使用基因本體論（GO），直系同源蛋白質(zhì)簇（COG）和《京都議定書》的基因和基因組百科全書（KEGG）代謝途徑進(jìn)行了分析�？偣矙z測到3235個蛋白質(zhì)，定量了3161個蛋白質(zhì)，其中401個是差異蛋白質(zhì)。揭示了208個下調(diào)蛋白和193個上調(diào)蛋白。篩選出77個靶向的顯著差異表達(dá)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析，并將其分為10類：氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，異構(gòu)酶，熱休克蛋白，裂解酶，水解酶，連接酶，合成酶，微管蛋白和肌動蛋白。結(jié)果表明，天然富硒稻的抗逆，抗氧化，活性氧代謝，碳水化合物和氨基酸代謝均高于非硒稻。發(fā)現(xiàn)在非富硒水稻中淀粉合成途徑的激活是豐富的。半胱氨酸合酶（CYS）和甲基轉(zhuǎn)移酶（metE）可能是引起氨基酸差異的兩個關(guān)鍵蛋白。OsAPx02，CatC，riPHGPX，HSP70和HSP90可能是調(diào)節(jié)兩種水稻抗氧化和抗應(yīng)激作用差異的關(guān)鍵酶。這項研究提供了有關(guān)富硒和非富硒水稻中蛋白質(zhì)機(jī)制和次生代謝產(chǎn)物偏差的基本信息。
前言
硒對植物的生長發(fā)育有許多影響。它調(diào)節(jié)光合作用，呼吸作用，增強(qiáng)抗逆性并減輕自由基的破壞，同時還減輕了重金屬的毒性作用。世界上約有一半人口食用大米（OryzasativaL.）作為主食。因此，通過育種使其生物強(qiáng)化是一個長期且相對無風(fēng)險的過程。水稻基因組的測序和研究比其他農(nóng)作物更多。此外，水稻中富硒的分子機(jī)制尚不清楚。
用于相對定量和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)的等壓標(biāo)記是一種通過串聯(lián)質(zhì)譜法在定量蛋白質(zhì)組學(xué)中用于確定來自不同來源的蛋白質(zhì)量的等壓標(biāo)記方法。它使用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記分子對樣品蛋白質(zhì)或肽片段進(jìn)行準(zhǔn)確的定性鑒定和定量分析。它可以對不同樣品中蛋白質(zhì)的絕對或相對含量進(jìn)行比較，以鑒定差異蛋白質(zhì)和功能。
在該實(shí)驗中，使用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了蛋白質(zhì)和代謝組水平下富硒和富硒天然水稻中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)�；虮倔w論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝途徑用于分析與水稻生物學(xué)相關(guān)的差異蛋白譜和信號傳導(dǎo)途徑。這些蛋白質(zhì)的功能注釋和表征將提供基本信息，并有助于詳細(xì)研究硒反應(yīng)機(jī)制。通過生物信息學(xué)分析和驗證所確定的信號通路，將為進(jìn)一步研究富硒水稻的抗氧化和抗衰老機(jī)制提供基礎(chǔ)。
方法
蛋白質(zhì)鑒定與生物信息學(xué)分析
采用了基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的基本過程。通過系列優(yōu)化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后將其與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較以對蛋白質(zhì)評分以進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。使用ProteinpilotTMV4.5在水稻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中搜索肽段的MS/MS數(shù)據(jù)。獨(dú)特肽段顯示蛋白質(zhì)組獨(dú)特肽段序列的數(shù)量。僅考慮具有至少一個獨(dú)特肽且未使用值大于1.3的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析，并對其進(jìn)行t檢驗。當(dāng)差異為1.5倍或更大時（即，上調(diào)≥1.5，下調(diào)≤0.67），則被視為差異顯著的蛋白質(zhì)（p值≤0.05）。注釋功能用于執(zhí)行差異蛋白的基因功能聚類（GO分析）。京都百科全書的基因和基因組途徑數(shù)據(jù)庫用于分析涉及差異蛋白的代謝途徑。所識別蛋白質(zhì)的物理，化學(xué)性質(zhì)和分布用Excel圖形表示。
結(jié)果
質(zhì)譜鑒定結(jié)果
通過ProteinpilotTM軟件（V4.5，Boston，MA，USA）在水稻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中搜索質(zhì)譜數(shù)據(jù)。鑒定出3235種蛋白質(zhì)的總譜，報告可信度超過95％。其中，定量了3161種蛋白質(zhì)，進(jìn)一步由401種差異表達(dá)蛋白質(zhì)組成。特異顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析揭示了富硒水稻中大量下調(diào)的修飾蛋白質(zhì)（208個）和非硒水稻中大量上調(diào)的修飾蛋白質(zhì)（193個）。蛋白質(zhì)的分子量范圍為8.2kDa至611.3kDa，等電點(diǎn)范圍為3.18至12.77，疏水性范圍為-2.01至1.29，如圖1所示。當(dāng)疏水性數(shù)據(jù)>0時，越大值，親水性越強(qiáng)。相比之下，當(dāng)數(shù)據(jù)＜0時，發(fā)現(xiàn)該值越小，疏水作用越強(qiáng)。（注：定量的蛋白質(zhì)數(shù)量、分子量范圍、等電點(diǎn)范圍和疏水性范圍等基本信息）
對鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO，KEGG和COG注釋，以全面反映這些蛋白質(zhì)在各種生命活動中的生物學(xué)功能和意義。從富硒和非富硒水稻中獲得的所有蛋白質(zhì)的功能注釋顯示總共3235種差異蛋白質(zhì)。其中，3122種蛋白質(zhì)被細(xì)分為53種具有層次結(jié)構(gòu)的GO分類（圖2）。COG分類發(fā)現(xiàn)R類（僅用于一般功能預(yù)測）顯著富集并包含452種蛋白質(zhì)（圖2和3）。通過KEGG鑒定出的差異代謝途徑中有1599種蛋白質(zhì)被細(xì)分為116種分類（圖2）。（將篩選出的差異蛋白在GO、KEGG和COG進(jìn)行功能注釋）
基因本體是一種全面的方法，它可以指示生物中基因和基因產(chǎn)物的特性。為了得到詳細(xì)的描述，GO被進(jìn)一步分為三個組成部分。例如，生物過程，細(xì)胞成分和分子功能。富硒和非富硒水稻之間的生物過程相關(guān)GO術(shù)語揭示了401個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，主要參與28種不同功能。富硒和非富硒水稻的GO差異分析表明，與上調(diào)基因相比，下調(diào)基因的數(shù)量更多。
直系同源蛋白質(zhì)簇是用于直系同源蛋白質(zhì)分類的數(shù)據(jù)庫。我們將識別出的差異蛋白與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比較，以預(yù)測這些蛋白的可能功能，然后對其進(jìn)行功能分類統(tǒng)計（圖3）。排在前5位的COG類別最高的是：R，O，J，G和C。推論每個類別的功能是：一般功能預(yù)測（16.91％）；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化，翻譯修飾，伴侶蛋白（12.76％）;參與翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生（8.8％）；碳水化合物運(yùn)輸和代謝（8.7％）；以及能源的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化（8％）。結(jié)果表明，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與翻譯后修飾，碳水化合物和核糖體運(yùn)輸。他們還在某種程度上參與了能量生產(chǎn)和氨基酸運(yùn)輸。
不同的蛋白質(zhì)在體內(nèi)彼此協(xié)調(diào)以表達(dá)其生物學(xué)行為。因此，基于途徑的注釋拓寬了對其生物學(xué)功能的進(jìn)一步了解。KEGG是一個主要的公共途徑相關(guān)數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/）。途徑分析可以確定蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的重要生化途徑，代謝途徑和信號傳導(dǎo)途徑。KEGG數(shù)據(jù)庫的結(jié)果表明，差異蛋白總共參與了90條信號通路（表4）。前10個代謝途徑是淀粉和蔗糖代謝途徑（9.03％），糖酵解和糖異生途徑（9.03％），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工途徑（6.94％），核糖體代謝（6.6％），光合生物炭固定途徑（5.21％），果糖和甘露糖代謝（4.86％），半乳糖代謝（4.17％），氨基酸，核苷酸葡萄糖代謝（4.17％），嘌呤代謝（4.17％）和丙酮酸代謝（4.17％）。表4給出了表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量和途徑ID。
正如GO所披露的，某些途徑的上調(diào)和下調(diào)的DEP之間的差異令人著迷，如圖5所示。發(fā)現(xiàn)諸如“細(xì)胞外區(qū)域部分”，“病毒繁殖”和“核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性”等途徑僅在非富硒水稻中表達(dá)。硒反應(yīng)性差異表達(dá)蛋白主要與多種細(xì)胞功能有關(guān)，這些功能與細(xì)胞過程，細(xì)胞和細(xì)胞部分的主要成分，離子結(jié)合和催化活性有關(guān)（圖5）。
可以在圖6中看到標(biāo)注到S727和S3057的前10個DEP的KEGG功能途徑統(tǒng)計餅圖。從結(jié)果可以看出，富硒和不富硒的前10個功能途徑的表達(dá)是不同的白飯。從GO，KEGG注釋分析可以明顯看出，代謝途徑是401種差異蛋白中含量最高的途徑。盡管在兩個水稻組中最常見的途徑是代謝途徑，但富含硒的水稻（73％）中該途徑并發(fā)的趨勢似乎最為明顯。在前10條帶注釋的途徑中有6種相同的功能，但是在兩種水稻類型中，這些途徑富硒和非富硒大米分別占比是不同的。水稻中對硒有響應(yīng)的DEPs的表達(dá)更多。因此，富硒水稻似乎比非富硒水稻具有更好的分子功能和調(diào)控作用。
最后，根據(jù)表達(dá)水平，分子功能和代謝途徑篩選出77種靶向差異蛋白（圖7）。根據(jù)它們作為氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，異構(gòu)酶，熱休克蛋白，裂解酶，水解酶，連接酶，合成酶，微管蛋白和肌動蛋白的功能將它們進(jìn)一步分類。每個類別的比較表明，對于大多數(shù)類別，富硒水稻中表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量更多。非富硒水稻中水解酶和連接酶的蛋白質(zhì)數(shù)量更多。兩種水稻中表達(dá)的裂解酶功能蛋白相同。
富硒和非富硒水稻的比較注釋分析結(jié)果表明，蛋白質(zhì)組表達(dá)水平存在顯著差異。一系列生物信息學(xué)分析指出了401種差異蛋白的存在。其中77種靶向差異蛋白根據(jù)其功能分為10組：氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，異構(gòu)酶，熱休克蛋白，裂解酶，水解酶，連接酶，合成酶，微管蛋白和肌動蛋白。表5中進(jìn)一步討論了功能分布。
這項研究為不同水稻基因型之間的次生代謝差異提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并在蛋白質(zhì)水平上發(fā)現(xiàn)了重要信息，可用于進(jìn)一步研究富硒食品。
基于iTRAQ技術(shù)對水稻進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組差異表達(dá)水平上天然富硒水稻和非富硒水稻之間的差異。差異蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析表明，天然富硒水稻的抗應(yīng)激，抗氧化，活性氧代謝，碳水化合物和氨基酸代謝均優(yōu)于非富硒水稻。但是，在非富硒水稻中淀粉合成途徑明顯更多。這項研究為富硒和非富硒水稻中的蛋白質(zhì)組分析和蛋白質(zhì)差異表達(dá)提供了有趣的見解。在自然界中，硒是許多生物和代謝過程的主要貢獻(xiàn)者，并具有清除作用。然而，目前的研究培育了我們對該微量元素功能的理解，并揭示了硒的蛋白質(zhì)機(jī)制。
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用水稻富硒葉面肥種植出的富硒水稻差異蛋白質(zhì)表達(dá)研究
日期:2021/11/20 點(diǎn)擊:719 文章來源:安徽硒無憂現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司
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